ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ХИМИИ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА И КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Главная » Естественные науки » ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ ХИМИИ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА И КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Естественные науки Комментариев нет

Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний занимают клю — чевое место при экологическом мониторинге природных очагов инфекций и в клинической лабораторной диагностике. Ввиду сложности задач такого анализа возникает ряд проблем, наиболее существенными из которых являются: низкая концентрация возбудителей в про- бах из природных источников (вода, почва, воздух), материалах (суспензии из переносчиков, суспензии из органов животных), пробах из биологических жидкостей организма человека и животных (кровь, моча, ликвор и др.); возможное присутствие в анализируемых пробах не — скольких болезнетворных агентов различных таксономических групп (бактерии, риккетсии, вирусы), сапрофитной микрофлоры, а также неспецифических мешающих примесей (пыль,

© кострюкова Т. С. Васильев н. В., 2011.

различные органические и неорганические вещества), затрудняющих учет и интерпрета — цию результатов [2; 4, 151; 5; 8].

к разрабатываемым реагентам иммуно — флуоресцентного анализа – одного из основ — ных видов анализа в медико-биологической практике, предъявляются жесткие требова — ния эффективности и временной задержки люминесценции, длинам волн возбуждения и т. д. Все эти факторы определяют чувстви- тельность, быстродействие, специфичность, производительность и возможности одно — временного выявления в пробе нескольких биоагентов [2]. В настоящей работе освеще — ны основные сведения, позволяющие опре — делить основные перспективы направлений разработки флуоресцентных меток и особен — но фторированных β-дикарбонильных аро — матических и гетероароматических соедине — ний, как одного из наиболее эффективных типов реагентов для иммунофлуоресцент — ного анализа. В настоящей работе не пресле — дуется цель дать исчерпывающий обзор по флуоресцентным меткам, применяющимся в иммуноанализе. достаточно полные обзоры по иммунофлуоресцентному анализу приве — дены в обзорных работах [2; 4, 151; 5; 8].

При проведении иммунофлуоресцентно-

иметь определенную растворимость в воде, быть достаточно устойчивой фотохимически и термодинамически. Большое время жизни в возбужденном состоянии ≥ 600 мкс. так — же является необходимым для современного иммунофлуоресцентного анализа [2; 8].

Метки, реализующие быструю люминес-

ценцию. наибольшее распространение на первоначальном этапе развития иммунофлу — оресцентного анализа получили метки на ос — нове ксантеновых красителей – производных

9-фенилксантена. наиболее известными яв-

ляются флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ), родамин изотиоцианат (РИТЦ) и другие [10;

15; 18] . Эти соединения до сих пор практи — чески применимы в медико-биологической практике. Мечение этими соединениями осу — ществляется за счет присоединения тиоизо- цианатной группы к нуклеофильным груп — пам – главным образом аминным группам, биологических молекул, реже упоминается присоединение по тиоловым группам еще реже по гидроксильным. Такое присоедине- ние достаточно эффективно осуществляется в водных растворах при рн, близких к ней — тральным, однако во многих случаях требует применения больших избытков реагентов.

го анализа используется следующий общий O принцип: при облучении образца «пучком» электромагнитного излучения метка, мар — O кирующая акт биоспецифического взаимо — HO действия, переходит в возбужденное состоя-

ние и затем излучает квант с длиной волны

большей, чем длина волны возбуждения.

Выбор метки чрезвычайно важен, поскольку

достигаемый аналитический эффект не дол — жен маскироваться свечением и рассеянием биологического материала, а также образцом

полимерной подложки – пластика планшета. Требования к флуоресцентной метке: флуо — ресцентная метка должна высокоэффективно поглощать свет, молекулярная экстинкция ε ≥

105 М -1 см-1; иметь высокий квантовый выход; различие между длинами волн возбуждения и флуоресценции должно превышать вели — чину ≥100 нм; обладать низкой неспецифи — ческой сорбцией на белках и поверхностях;

Рис. 1. Формулы ФИТЦ (а), РИТЦ (б) и типовая реакция присоединения изотиоцианатных меток к белку.

Аналитический эффект в этих методиках иммунофлуоресцентного анализа основан на регистрации поляризации ФИТЦ при био — специфическом связывании пары реагент

– аналит, один из компонентов которой был

конъюгирован с меткой [12]. При этом, чем сильнее изменяется сигнал люминесценции меченых ФИТЦ молекул анализируемого ве — щества, связанного с антителами, тем выше концентрация искомого аналита в пробе. Метки типа ФИТЦ характеризуются высоки — ми коэффициентами экстинции, высокими квантовыми выходами, однако обладают ма- лым стоксовым сдвигом, фотовыцветаемы и имеют низкие временные задержки люминес — ценции, что определяется «быстрым» меха — низмом их люминесценции [2]. ксантеновые красители ряда флуоресцеина и родамина в настоящее время модифицированы и содер — жат в качестве функциональных групп сук — цинимидные [3], малеинимидные фрагменты ( n-(7-диметиламино-4-метил-2-окси-3-хро — менил) малеимид дАкМ) [16]. некоторые реагенты, разработанные на ранних стадиях развития анализа, содержат карбоксильные группы, и их мечение осуществляется “in situ” сшивающим реагентом – дициклогек- силкарбодиимидом. Такие метки, к примеру, эритрозин [17], а также карбоксилсодержа — щие порфирины и хлорины, характеризуются чрезвычайно высокими значениями кванто — вых выходов и экстинкции, например, копро — порфирин (I) [2; 9]. Рассмотренные структу — ры люминесцентных меток характеризуются быстрой люминесценцией, что ограничивает чувствительность в методиках медико-био — логического анализа при их применении.

реагенты, применяемые в иммунофлу-

оресцентных методах с временной задерж — кой. Основные достижения современного иммунофлуоресцентного анализа связаны с развитием методик с использованием дли — тельно люминесцирующих реагентов, – ком- плексов редкоземельных металлов (еu, Тb, Sm, dy) или комплексов металлов группы платины (Pt, Pd). Преимуществом этих ком — плексов являются длительные времена жиз — ни возбужденных состояний, вследствие ме — ханизмов их люминесценции. Регистрация эмиссии кванта осуществляется в стробоско — пическом режиме флуориметрами, позволя — ющими измерять флуоресценцию с разным временем задержки относительно возбужда-

ющих импульсов (рис. 2) [11]. В связи с “от — сечением” короткоживущей люминесценции, флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением в милли — и микросекундном диапазоне времен затухания люминесценции позволяет регистрировать предельно низкое содержание люминесцентных меток (10-14 М и более для ионов европия [13]). Анализ про — водится как в объеме пробы, так и на твердой фазе, и в мультианалитном варианте анализа на биочипах с несколькими флуорохромами.

Рис 2. Регистрация фосфоресценции с временным разрешением

В объемных методах наибольшее распро — странение в последние 30 лет получили ме — тоды лантанидного иммунофлуоресцентного анализа (ЛИФА) [2; 8]. для мечения биоспе — цифического взаимодействия в этом методе применяются тиоизоцианатные производ — ные полиаминокарбоновых кислот, а глав — ным компонентом в составе усиливающего раствора является ароматический фториро — ванный β-дикетон. как правило, это 2-нафто — илтрифторцетон (нТА), который перехваты — вает Eu+3, выполняя роль комплексона иона и фотосенсибилизатора.

Образующийся в результате перекомплек — сообразования комплекс Eu+3 с β-дикетоном, собственно, и детектируется люминесцент — ным методом.

Метки на основе фторированных β-ди — кетонов. Фторированные β-дикетоны дав — но привлекают внимание как эффективные комплексоны металлов, применяемые в им — мунофлуоресцентном анализе [21]. наибо —

лее перспективными считаются комплексы фторированных β-дикетонов, содержащие ароматические и гетероароматические за — местители, что определяется повышенной устойчивостью этих комплексов, особенно в кислых средах, а также хорошими хромо-

форными свойствами [21]. Люминесценция

комплексов РЗЭ существенно «тушится» при гидратации, однако при создании комплек — сов на основе фторированных гидрофобных β-дикетонов, вода эффективно вытесняет — ся из внутренней сферы [19]. Перспективы

разработки меток на основе β-дикетонов преследуют цель избавиться от недостатков, присущих разделительным технологиям (ме — тод «дельфиа»). Сокращение трудоемкой и длительной стадии перекомплексообразова — ния в настоящее время реализовано рядом авторов. Одним из примеров молекулярно — го конструирования β-дикетонатных меток явился синтез фторированного тетракетона на основе дибензотиофена, который подши — вается к белкам за счет хлорсульфонильных групп [23]. Определение антител по методи — ке с временной задержкой с использованием этого реагента имеет чувствительность на уровне 10-15М.

В последние годы в нашей стране разрабо — таны реагенты для иммунофлуоресцентного анализа, сравнимые, и даже превосходящие зарубежные аналоги. Существенный вклад в разработку этих реагентов внесен науч — ной химической школой Московского госу — дарственного областного университета в со — трудничестве с Институтом биологического приборостроения МЗ РФ. Синтезирован ряд фторированных тетракетонов и тетракетоди — эфиров – производных нафталина, которые выгодно отличаются от нТА повышенной устойчивостью их комплексов с Eu3+ [1]. Фто- рированные гетероциклические β-дикетоны опубликованы в качестве новых аналитичес-

ких реагентов комплексообразующего типа, для допирования наночастиц и для использо-

вания в области люминесцентно-спектраль-

ного анализа, в частности, для клинической диагностики объектов биогенного проис — хождения [3; 7].

Тетракетоны на основе флуорена, карбазо — ла, дибензофурана и дибензотиофена, в кото — рых содержатся различные полифторалкиль — ные заместители, изучены в работах [6; 7].

Особенноинтереснымиявляютсяпроизвод — ные флуорена и особенно карбазола, которые имеют максимумы возбуждения люминесцен — ции, расположенные в области свыше 360 нм, что позволяет использовать для возбуждения в случае карбазольных комплексов дешевые светодиоды. Соединения образуют стабильные комплексы с Eu3+, не диссоциирующие вплоть до концентраций 10-11 – 10-12 М. Приведены данные о включении европейных комплексов в меламиноформальдегидные латексные час — тицы, проведен иммуноанализ тиреотропного гормона человека с использованием в усили — вающем растворе разработанных реагентов. Уникальные свойства полученных реагентов и их комплексов позволили осуществить на их основе получение ковалентно связанных нано — частиц различных типов, применимых в целях иммунофлуоресцентного анализа, в том числе для создания биочипов [4, 151].

Следует констатировать, что на сегодняш — ний день не создано оптимальной флуорес-

центной метки на основе β-дикетонатных хелатов ионов редкоземельных элементов. Постоянно возрастающие требования к эко — логическому и медико-биологическому кли — ническому анализу диктуют необходимость разработки новых, все более совершенных аналитических реагентов. В последние годы специалистами Московского государствен — ного областного университета в сотрудни — честве с Институтом биологического при — боростроения МЗ РФ разработаны новые перспективные реагенты для коньюгирова — ния с белками и для создания нано — и микро — дисперсий. дальнейшее совершенствование таких реагентов может существенно улуч — шить возможности проведения безраздели — тельного иммунофлуоресцентного анализа, а также создаст препаративную базу для созда — ния флуоресцирующих нано — и микрочастиц, нашедших применение в биочипах.

Материал взят из: Вестник МГОУ «Естественные ануки» — №5 — 2001

(Visited 4 times, 1 visits today)